MilliporeECL發(fā)光液比DAB顯色靈敏度高千倍以上。在暗房內高豐度蛋白條帶的熒光常常數小時內仍然肉眼可見，X線膠片曝光5～30s即可得到高清晰條帶；低豐度蛋白條帶熒光肉眼可能不易察覺，但曝光30s~5min即可檢測條帶；極低豐度的蛋白條帶熒光可允許30min~12h曝光以檢測目的條帶。MilliporeECL發(fā)光液衰減較慢，20min內熒光幾無減弱，檢測時產生的非特異背景非常低，也可節(jié)省抗體和待測樣品的用量
 

　　1.保鮮膜的質量。a.國產的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應不充分，另一方面ECL所含液體會溶解試驗臺上殘留未知的化學藥品顆粒(也許你或其他人曾經不小心打翻過某種化合物)、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡述原理時，我曾經提到過很多化合物、金屬離子能直接催化過氧化物水解，在極短的時間內消耗掉所有的HRP酶，熒光轉瞬即逝。
 

　　b.保鮮膜的化工原料或拉制過程中，殘留未知的化學試劑，引起熒光淬滅；廉價的保鮮膜問題尤多。
 

　　目前，國產的就“妙潔”比較過關，保鮮膜厚度和化學物殘留都不影響ECL顯影。
 

　　如果買不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，好不要有任何化學試劑殘留，包括風干的TBST鹽結晶顆粒。
 

　　2.ECL孵育結束后膜需要控干。中學物理學過水會吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會干擾熒光強度，所以ECL孵育結束時需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請注意不能讓膜干掉。某些信號較弱的ECL，膜干掉后熒光會消失；較好的試劑盒，熒光相對穩(wěn)定，但吸干以后，背景熒光也會升高，而且會嚴重影響重新標記新抗體時的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。
 

　　3.控干的膜要仔細用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時，包裹保鮮膜時要細心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過度消耗，呈線條狀淬滅。
 

　　4.在膜放入壓片夾之前，好肉眼觀察一下熒光信號的強弱，這有利于判斷實驗可能出現(xiàn)的問題。很多人提問看見很強的熒光了，但怎么壓片都沒有信號，那么就是快速淬滅(閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號)造成的；有這個觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實驗操作應該問題不大，而問題主要是淬滅。如果你省略這個步驟，那問題就非常復雜了，因為之前任何操作都可能導致白板，根本無法判斷。